Закон ідеального газу. Експериментальний: Основними параметрами газу є...
Гістологія – («гістос» грецьк. – тканина, логіс – вчення) Це наука про будову, розвиток та життєдіяльність тканин багатоклітинних організмів і людини. Неозброєному оку недоступні об'єкти, які є предметом цієї науки. Тому історія гістології тісно пов'язана з істроєю створення таких приладів, які дозволяють вивчити найдрібніші предмети, неозброєним оком. 2
Курс гістології умовно поділено на такі розділи: 1. Цитологія – наука про клітину. n 2. Ембріологія – наука про розвиток, від зародження до повного формування організму. 3. Загальна гістологія - наука про загальні закономірності, властивих тканин. n 4. Приватна гістологія – вивчає будову, розвиток органів та систем.
ЦИТОЛОГІЯ – (грец. κύτος «клітина» і λόγος - «вчення», «наука») Розділ біології, що вивчає живі клітини, їх органоїди, їх будову, функціонування, процеси клітинного розмноження, старіння та смерті. 4
ембріологія n (від ін. -грец. ἔμβρυον - ембріон, зародок + -λογία від λόγος - вчення) - це наука, що вивчає розвиток зародка. 5
Історія створення клітинної теорії 1590. Янсен винайшов мікроскоп, у якому збільшення забезпечувалося з'єднанням двох лінз. 1665 рік. Роберт Гук уперше вжив термін клітка. 1650 –1700 роки. Антоні ван Левенгук вперше описав бактерії та інші мікроорганізми. 1700 –1800 роки. Опубліковано багато нових описів та малюнків різних тканин, переважно рослинних. 1827 року Карл Бер виявив яйцеклітину у ссавців. 1831 –1833 роки. Роберт Броун описав ядро у рослинних клітинах. 1838 –1839 роки. Ботанік Матіас Шлейден та зоолог Теодор Шванн об'єднали ідеї різних учених та сформулювали клітинну теорію, яка постулювала, що основною одиницею структури та функції в живих організмах є клітина. 1855 рік. Рудольф Вірхов показав, що це клітини утворюються внаслідок клітинних поділів.
Історія створення клітинної теорії 1665 рік. Розглядаючи під мікроскопом зріз пробки, англійський вчений, фізик Роберт Гук виявив, що вона складається із осередків, розділених перегородками. Ці осередки він назвав "клітинами"
Історія створення клітинної теорії У XVII столітті Левенгук сконструював мікроскоп і відчинив людям двері до мікросвіту. Перед очима здивованих дослідників замиготіли найрізноманітніші інфузорії, коловратки та інша найдрібніша живність. Виявилося, що вони всюди – ці дрібні організми: у воді, гною, у повітрі та пилу, у землі та водостічних жолобах, у гниючих відходах тваринного та рослинного походження.
Історія створення клітинної теорії 1831 –1833 роки. Роберт Броун описав ядро у рослинних клітинах. У 1838 р. німецький ботанік М. Шлейден привернув увагу ядру, вважав його утворювачем клітини. За Шлейденом, із зернистої субстанції конденсується ядерце, навколо якого формується ядро, а навколо ядра - клітина, причому ядро в процесі утворення клітини може зникати.
Історія створення клітинної теорії Німецький зоолог Т. Шван показав, що з клітин складаються і тканини тварин. Він створив теорію, яка стверджує, що клітини, що містять ядра, є структурною і функціональною основою всіх живих істот. Клітинна теорія будови була сформульована і опублікована Т. Шванном в 1839 р. Суть її можна виразити в таких положеннях: 1. Клітина – елементарна структурна одиниця будови всіх живих істот; 2. Клітини рослин і тварин самостійні, гомологічні другові за походженням і структурою. Кожна клітина функціонує незалежно від інших, але з усіма. 3. Усі клітини виникають із безструктурної міжклітинної речовини. (Помилка!) 4. Життєдіяльність клітини визначається оболонкою. (Помилка!)
Історія створення клітинної теорії У 1855 р. німецький лікар Р. Вірхов зробив узагальнення: клітина може виникнути лише з попередньої клітини. Це призвело до усвідомлення того факту, що зростання та розвиток організмів пов'язані з розподілом клітин та їх подальшим диференціюванням, що призводить до утворення тканин та органів.
Історія створення клітинної теорії Карл Бер Ще в 1827 Карл Карл виявив яйцеклітину у ссавців, довів, що розвиток ссавців починається з заплідненої яйцеклітини. Отже, розвиток будь-якого організму починається з однієї заплідненої яйцеклітини, клітина є одиницею розвитку.
Історія створення клітинної теорії 1865 Опубліковано закони спадковості (Г. Мендель). 1868 Відкрито нуклеїнові кислоти (Ф. Мішер) 1873 Відкрито хромосоми (Ф. Шнейдер) 1874 Відкритий мітоз у рослинних клітин (І. Д. Чистяков) 1878 Відкрито мітотичний поділ тварин клітин (В. Флемінг, П. Флемінг .І. Перемежко) 1879 р. Флемінг - поведінка хромосом під час поділу. 1882 Відкрито мейоз у тварин клітин (В. Флемінг) 1883 Показано, що в статевих клітинах число хромосом в два рази менше, ніж у соматичних (Е. Ван Бенеден) 1887 Відкритий мейоз у рослинних клітин (Е. Страсбургер ) 1898 р. Гольджі відкрив сітчастий апарат клітини, апарат Гольджі. 1914 Сформульована хромосомна теорія спадковості (Т. Морган). 1924 Опубліковано природничо-наукова теорія походження життя на Землі (А. І. Опарін). 1953 Сформульовані уявлення про структуру ДНК і створена її модель (Д. Вотсон і Ф. Крик). 1961 р. Визначено природу та властивості генетичного коду (Ф. Крик, Л. Барнет, С. Беннер).
Основні положення сучасної клітинної теорії 1. Клітина - елементарна жива система, одиниця будови, життєдіяльності, розмноження та індивідуального розвиткуорганізмів. 2. Клітини всіх живих організмів гомологічні, єдині за будовою та походженням. 3. Утворення клітин. Нові клітини виникають тільки шляхом поділу клітин, що існували раніше. 4. Клітина та організм. Клітина може бути самостійним організмом (прокаріоти та одноклітинні еукаріоти). Усі багатоклітинні організмискладаються із клітин. 5. Функції клітин. У клітинах здійснюються: обмін речовин, дратівливість та збудливість, рух, розмноження та диференціювання. 6. Еволюція клітини. Клітинна організація виникла на зорі життя і пройшла тривалий шлях еволюційного розвитку від без'ядерних форм (прокаріотів) до ядерних (еукаріотів).
МЕТОДИ МІКРОСКОПІЮВАННЯ ГІСТОЛОГІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ 1. Світлова мікроскопія. 2. Ультрафіолетова мікроскопія. 3. Флюоресцентна (люмінесцентна) мікроскопія. 4. Фазово-контрастна мікроскопія. 5. Мікроскопія у темному полі. 6. Інтерференційна мікроскопія 7. Поляризаційна мікроскопія. 8. Електронна мікроскопія. 17
Мікроскоп n Цей оптичний пристрій дозволяє спостерігати дрібні об'єкти. Збільшення зображення досягається системою лінз об'єктиву та окуляра. Дзеркало, конденсор та діафрагма направляють світловий потік та регулюють освітлення об'єкта. Механічна частина мікроскопа включає: штатив, предметний столик, макро- та мікрометричні гвинти, тубусоутримувач. 18
Спеціальні методи мікроскопування: - фазовоконтрастний мікроскоп - (для вивч. живих неокраш-х об'єктів); - мікроскопія дозволяє вивчати живі та незабарвлені об'єкти. При проходженні світла через пофарбовані об'єкти змінюється амплітуда світлової хвилі, а при проходженні світла через незабарвлені - фаза світлової хвилі, що використовують для отримання висококонтрастного зображення у фазово-контрастній та інтерференційній мікроскопії. - Темнопольний мікроскоп (для вивч. живих неокраш-х об'єктів). Використовують спеціальний конденсор, що виділяє структурні структури незабарвленого матеріалу. Темнопільна мікроскопія дозволяє спостерігати живі об'єкти. Об'єкт, що спостерігається, виглядає як освітлений на темному полі. При цьому промені від освітлювача падають на об'єкт збоку, а в лінзи мікроскопа надходять лише розсіяні промені. 19
Спеціальні методи мікроскопування люмінесцентний мік-п (для вивч. живих неокраш-х об'єктів) мікроскопія застосовується для спостереження флюоресціюючих (люмінесцентних) об'єктів. У люмінесцентному мікроскопі світло від потужного джерелапроходить через два фільтри. Один фільтр затримує світло перед зразком та пропускає світло довжини хвилі, що збуджує флюоресценцію зразка. Інший фільтр пропускає світло довжини хвилі, що випромінюється флюоресціюючим об'єктом. Таким чином, флюоресцентні об'єкти поглинають світло однієї довжини хвилі і випромінюють в іншій області спектра. -ультрафіолетова здатність м-па) мік-п (підвищує роздільну здатність -поляризаційний мік-п (для ісл. об'єктів з упорядкованим розташуванням молекул - скелет. муск-ра, колагенові волокна і т. д.) мікроскопія - формування зображення незабарвлених анізотропних структур наприклад, колагенові волокна та міофібрили).
Спеціальні методи мікроскопування -інтерфекренційна мікроскопія (для опред-я сухого залишку в клітинах, визначення товщини об'єктів) - мікроскопія поєднує принципи фазово-контрастної та поляризаційної мікроскопії і застосовується для отримання контрастного зображення незабарвлених об'єктів. Спеціальна інтерференційна оптика (номарська оптика) знайшла застосування в мікроскопах з диференціальним інтерференційним контрастом. В. Електронна мікроскопія: -трансміційна (вивчення об'єктів на просвіт) -скануючий (вивчення поверхні об'єктів) Теоретично роздільна здатність ЕМ складає 0,002 нм. Реальна роздільна здатність сучасних мікроскопів наближається до 0, 1 нм. Для біологічних об'єктів дозвіл ЕМ практично становить 2 нм. 21
Спеціальні методи мікроскопування електронний мікроскоп, Що Просвітлює, складається з колони, через яку у вакуумі проходять електрони, випромінювані катодною ниткою. Пучок електронів, що фокусується кільцевими магнітами, проходить через підготовлений зразок. Характер розсіювання електронів залежить від густини зразка. Електрони, що проходять через зразок, фокусують, спостерігають на флюоресцентному екрані і реєструють за допомогою фотопластинки. Скануючий електронний мікроскоп застосовують для отримання тривимірного зображення поверхні об'єкта, що досліджується. Метод сколів (заморожування-сколювання) застосовують для вивчення внутрішньої будовиклітинних мембран. Клітини заморожують при температурі рідкого азоту у присутності кріопротектора та використовують для виготовлення сколів. Площини сколу проходять через гідрофобну середину подвійного шару ліпідів. Оголену внутрішню поверхню мембран відтіняють платиною, отримані репліки вивчають у сканувальному ЕМ. 22
Спеціальні (немікроскопічні) методи: 1. Цито- або гістохімія - суть полягає у використанні строгоспецифічних хімічних реакційзі світлим кінцевим продуктом у клітинах і тканинах визначення кількості різних речовин(білків, ферментів, жирів, вуглеводів тощо. буд.). Можна застосувати лише на рівні світлового чи електронного мікроскопа. 2. Цитофотометрія – метод застосовується в комплексі з 1 і дає можливість кількісно оцінити виявлені цитогістохімічним методом білки, ферменти тощо. 3. Авторадіографія – вводять в організм речовини, що містять радіоактивні ізотопи хімічних елементів. Ці речовини включаються до обмінних процесів у клітинах. Локалізацію, подальші переміщення цих речовин в органах визначаються на гістопрепаратах з випромінювання, яке уловлюється фотоемульсією, нанесеною на препарат. 4. Рентгентоструктурний аналіз – дозволяє визначити кількість хімічних елементів у клітинах, вивчити молекулярну структуру біологічних мікрооб'єктів. 24 5. Морфометрія – вимір розмірів біол. структур на клітинному та субклітинному рівні.
Спеціальні (немікроскопічні) методи 6. Мікроургія - проведення дуже тонких операцій мікроманіпулятором під мікроскопом (пересадка ядер, введення в клітини різних речовин, вимірювання біопотенціалів тощо). імплантованих у різні тканини організму. 7. Ультрацентрофугування - фракціонування клітин або субклітинних структур шляхом центрофугування в розчинах різної густини. 8. Експериментальний метод. 9. Метод трансплантації тканин та органів. 25
Фіксація зберігає структуру клітин, тканин та органів, запобігає їх бактеріальному забрудненню та ферментному перетравленню, стабілізує макромолекули шляхом їх хімічного зшивання. 32
Фіксуюча рідина формалін, спирти, глутаральдегід - найпоширеніші фіксатори; Кріофіксація - Найкраще збереження структур забезпечує миттєве заморожування зразків у рідкому азоті (-196 ° С); Ліофілізація – невеликі шматочки тканини піддаються швидкому заморожуванню, яке припиняє метаболічні процеси. Зневоднення-стандартна процедура видалення води-зневоднення в спиртах, зростаючої міцності (від 70 до 60%). Заливка – робить тканину міцною, запобігає її роздаванню та зминанню при різанні, дає можливість отримувати зрізи стандартної товщини. Найбільш поширене середовище для заливання – парафін. Використовують також целоідин, пластично середовища і смоли. 33
Зневоднення готує фіксовану тканину до проникнення до неї середовищ для заливання. Вода живої тканини, а також вода фіксуючих сумішей (більшість фіксаторів – водні розчини) після фіксації має бути повністю видалена. Стандартна процедуравидалення води – зневоднення у спиртах зростаючої від 60° до 100° фортеці. 34
Заливка – необхідна процедура, що запобігає приготуванню зрізів. Заливка робить тканину міцною, запобігає її роздавлюванню і зминанням при різанні, дає можливість отримати тонкі зрізи стандартної товщини. Найбільш поширене середовище для заливання – парафін. Використовують також целоїдин, пластичні середовища та смоли. 35
Ротаційний мікротом. 40 n Блоки, що містять шматочок органу, закріплюють у рухомому об'єктоутримувачі. При його опусканні на ножі залишаються серійні зрізи, їх знімають із ножа та монтують на предметне скло для подальшої обробки та мікроскопування.
Методи фарбування гістозрізів: n Ядерні (основні): n гематоксилін – забарвлює n n n n ядра в синій колір; залізний гематоксилін; азур II (у фіолетовий); кармін (у червоний); сафранін (у червоний); метиловий синій (у синій); толуїдиновий (у синій); тіоніновий (у синій). n Цитоплазматичні-(кислі): n еозин - в рожевий; n еритрозин; n помаранчевий «G»; n кислий фуксин - червоний; n пікринова кислота - в жовтий; n конго – червоний – у червоний 44
СПЕЦІАЛЬНІ Методи фарбування гістозрізів n Судан III –забарвлення ліпідів та жирів у помаранчевий колір; n осмієва кислота – забарвлення ліпідів та жирів у чорний колір; n орсеїн -забарвлення еластичних волокон у коричневий колір; n азотнокисле срібло – імпрегнація нервових елементів у темно-коричневий колір. 45
Структури клітин: n ОКСИФІЛІЯn здатність фарбуватися кислими барвниками в рожевий колір n Базофіліяn здатність фарбуватися основними барвниками в синій колір n Нейтрофілія – n здатність фарбуватися кислими та основними барвниками у фіолетовий колір. 47
1
Клітина n - це елементарна жива система, що складається з цитоплазми, ядра, оболонки і є основою розвитку, будови та життєдіяльності тварин та рослинних організмів.
Глікокалікс-надмембранний комплекс, складається з сахаридів, пов'язаних з білками і сахаридів, пов'язаних з ліпідами. Функції n Рецепція (гормони, цитокіни, медіатори та антигени) n Міжклітинні взаємодії (подразливість і впізнавання) n Постінне травлення (мікроворсинки клітин клітин кишечника)
Функції цітолеми: - Розмежувальна; - активний та пасивний транспорт речовин в обидві сторони; - рецепторні функції; -контакт із сусідніми клітинами.
У сучасній гістології, цитології та ембріології застосовуються різноманітні методи дослідження, що дозволяють всебічно вивчати процеси розвитку, будови та функції клітин, тканин та органів.
Головними етапами цитологічного та гістологічного аналізу є вибір об'єкта дослідження, підготовка його для вивчення у мікроскопі, застосування методів мікроскопування, а також якісний та кількісний аналіз зображень.
Об'єктами дослідження служать живі та мертві (фіксовані) клітини та тканини, та їх зображення, отримані у світлових та електронних мікроскопах.
Основним об'єктом дослідження є гістологічні препарати, виготовлені з фіксованих структур. Препарат може являти собою мазок(наприклад, мазок крові, кісткового мозку, слини, спинномозкової рідини та ін.), відбиток(наприклад, селезінки, тимусу, печінки), плівкуз тканини (наприклад, сполучної або очеревини, плеври, м'якої мозкової оболонки), тонкий зріз. Найчастіше вивчення використовується зріз тканини чи органа. Гістологічні препарати можуть вивчати без спеціальної обробки. Наприклад, приготовлений мазок крові, відбиток, плівка чи зріз органу можуть одразу розглядатися під мікроскопом. Але внаслідок того, що структури мають слабкий контраст, вони погано виявляються у звичайному світловому мікроскопі та потрібне використання спеціальних мікроскопів (фазово-контрастні та ін.). Тому частіше застосовують спеціально оброблені препарати: фіксовані, укладені у тверде середовище та забарвлені.
Процес виготовлення гістологічного препаратудля світлової та електронної мікроскопії включає такі основні етапи:
- 1. взяття матеріалу та його фіксація,
- 2. ущільнення матеріалу,
- 3. приготування зрізів,
- 4. фарбування чи контрастування зрізів.
Для світлової мікроскопії потрібен ще один етап - укладання зрізів у бальзам або інші прозорі середовища.
Фіксаціязабезпечує запобігання процесам розкладання, що сприяє збереженню цілісності структур. Це досягається тим, що взятий з органу невеликий зразок або занурюють у фіксатор (спирт, формалін, розчини солей важких металів, осмієва кислота, спеціальні фіксуючі суміші), або піддають термічній обробці. Під дією фіксатора у тканинах та органах відбуваються складні фізико-хімічні зміни. Найбільш істотним із них є процес незворотної коагуляції білків, внаслідок якого життєдіяльність припиняється, а структури стають мертвими, фіксованими. Фіксація призводить до ущільнення та зменшення об'єму шматочків, а також до поліпшення подальшого забарвлення клітин та тканин.
Ущільненняматеріалу, необхідне приготування зрізів, проводиться шляхом просочування попередньо зневодненого матеріалу парафіном, целлоидином, органічними смолами. Швидше ущільнення досягається застосуванням методу заморожування шматочків, наприклад, рідкої вуглекислоті.
Приготування зрізіввідбувається на спеціальних приладах - мікротомах(для світлової мікроскопії) та ультрамікротомах(Для електронної мікроскопії). Дивись посилання - прилади для виготовлення зрізів.
Фарбуваннязрізів (у світловій мікроскопії) або напилення їх солями металів (в електронній мікроскопії) застосовують збільшення контрастності зображення окремих структур під час розгляду в мікроскопі. Методи забарвлення гістологічних структур дуже різноманітні та вибираються залежно від завдань дослідження. Див. форум гістологічні методики.
Гістологічні барвники (за хімічною природою) поділяють на кислі, основні та нейтральні. Як приклад можна навести найбільш уживаний барвник гематоксилін, який забарвлює ядра клітин у фіолетовий колір, і кислий барвник - еозін, що забарвлює цитоплазму в рожево-жовтий колір Виборча спорідненість структур до певних барвників обумовлена їх хімічним складомі фізичними властивостями. Структури, що добре фарбуються кислими барвниками, називаються оксифільними, а фарбуються основними -- базофільними. Наприклад, цитоплазма клітин найчастіше фарбується оксифільно, а ядра клітин - фарбуються базофільно.
Структури, що сприймають як кислі, так і основні барвники, є нейтрофільними (гетерофільними). Забарвлені препарати зазвичай зневоднюють у спиртах зростаючої міцності і просвітлюють у ксилолі, бензолі, толуолі або деяких оліях. Для тривалого збереження зневоднений гістологічний зріз укладають між предметним та покривним склом у канадський бальзам або інші речовини. Готовий гістологічний препарат можна використовувати для вивчення під мікроскопом протягом багатьох років.
Для електронної мікроскопії зрізи, отримані на ультрамікротомі, поміщають на спеціальні сітки, контрастують солями урану, свинцю та інших металів, після чого переглядають у мікроскопі та фотографують. Отримані мікрофотографії є об'єктом вивчення поряд з гістологічними препаратами.
МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ
ФДБОУ ВПО «САХАЛІНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ»
ПРИРОДНО НАУКОВИЙ ФАКУЛЬТЕТ
КАФЕДРА ЕКОЛОГІЇ І ПРИРОДОКОРИСТУВАННЯ
КОНТРОЛЬНА РОБОТА
з дисципліни «Гістологія та ембріологія риб
на тему «Методи дослідження у гістології»
Студент 2 курсу
Терьохів Степан Сергійович
Науковий керівник,
ст. викладач кафедри екології та природокористування
А.В. Бойко
Південно-Сахалінськ
Вступ
Гістологія - наука про особливості організації, функцій та розвитку тканин та тканинну будову органів. Основним об'єктом вивчення гістології служать тканини, які є філогенетично сформовані, топографічно і функціонально пов'язані клітинні системи та його похідні, у тому числі утворені органи. Для того щоб зрозуміти як це все влаштовано і працює, людству знадобилося пройти через багато, починаючи з лінз Антоні Ванн Левенгука, коли було започатковано вивчення всього живого, не видиме раніше. До сучасних методів вивчення, відносять основний, мікроскопування.
Мета роботи: Розглянути методи дослідження у гістології, навчитися працювати з гістологічними препаратами та розуміти сам процес вивчення тканин у різний спосібмікроскопування.
1. Методи дослідження у гістології, основа
Залежно від об'єкта вивчення гістологію поділяють на нормальну (вивчає тканини здорового організму) та патологічну (патогістологію), яка досліджує зміни тканин при захворюваннях та ушкодженнях (її зазвичай розглядають як розділ патологічної анатомії). У силу специфіки об'єкта та методів дослідження виділяють нейрогістологію, а також вчення про кров та кровотворення, що стало теоретичною основоюгематології. Крім того, розрізняють ряд напрямків у гістології - описову гістологію (опис тканин), порівняльну гістологію (порівняння тканин) різних видівтварин), еволюційну гістологію (закономірності розвитку тканин у філогенезі), екологічну гістологію (вивчає тканини у зв'язку з впливом умов проживання), експериментальну гістологію. У гістології використовують численні методи дослідження - мікроскопію, експериментальну, тканинну культуру (Афанасьєв 1989).
Основний предмет вивчення гістології - комплекси клітин, складові тканини, у тому взаємодії друг з одним і з проміжними середовищами. Як частина морфології, гістологія тісно пов'язані з цитологією, анатомією, ембріологією. Методологічну основу гістології складають клітинна теоріята еволюційне вчення. Гістологію прийнято розділяти на загальну (вивчає загальні закономірності розвитку, будови та функції тканин) та приватну (вивчає мікроскопічну будову окремих органів та систем організму). Спеціальними розділами гістології є гістохімія (хімія тканин) та гістофізіологія (механізми діяльності тканин) (Юшканцева 2006).
2. Методи дослідження
Методи дослідження в гістології включають приготування гістологічних препаратів з подальшим вивченням за допомогою світлового або електронного мікроскопа. Гістологічні препарати є мазками, відбитками органів, тонкими зрізами шматочків органів, можливо, забарвлені спеціальним барвником, поміщені на предметне скло мікроскопа, укладені в консервуюче середовище і вкриті покривним склом.
У сучасній гістології, цитології та ембріології застосовуються різноманітні методи дослідження, що дозволяють всебічно вивчати процеси розвитку, будови та функції клітин, тканин та органів.
Головними етапами гістологічного аналізу є вибір об'єкта дослідження, підготовка його вивчення у мікроскопі, застосування методів мікроскопування, і навіть якісний і кількісний аналіз зображень.
Об'єктами дослідження служать живі та мертві (фіксовані) клітини та тканини, та їх зображення, отримані у світлових та електронних мікроскопах.
Основним об'єктом дослідження є гістологічні препарати, виготовлені з фіксованих структур. Препарат може являти собою мазок (наприклад, мазок крові, кісткового мозку, слини, спинномозкової рідини та ін), відбиток (наприклад, селезінки, тимусу, печінки), плівку з тканини (наприклад, сполучної або очеревини, плеври, м'якої мозкової оболонки) тонкий зріз. Найчастіше вивчення використовується зріз тканини чи органа. Гістологічні препарати можуть вивчати без спеціальної обробки. Наприклад, приготовлений мазок крові, відбиток, плівка чи зріз органу можуть одразу розглядатися під мікроскопом. Але внаслідок того, що структури мають слабкий контраст, вони погано виявляються у звичайному світловому мікроскопі та потрібне використання спеціальних мікроскопів (фазово-контрастні та ін.). Тому частіше застосовують спеціально оброблені препарати: фіксовані, укладені у тверде середовище та забарвлені (Юріна 1999).
Процес виготовлення гістологічного препарату для світлової та електронної мікроскопії включає такі основні етапи:
взяття матеріалу та його фіксація,
ущільнення матеріалу,
приготування зрізів,
фарбування чи контрастування зрізів.
Для світлової мікроскопії необхідний ще один етап – укладання зрізів у бальзам чи інші прозорі середовища.
Фіксація забезпечує запобігання процесам розкладання, що сприяє збереженню цілісності структур. Це досягається тим, що взятий з органу невеликий зразок або занурюють у фіксатор (спирт, формалін, розчини солей важких металів, осмієва кислота, спеціальні фіксуючі суміші), або піддають термічній обробці. Під дією фіксатора в тканинах та органах відбуваються складні фізико-хімічні зміни. Найбільш істотним із них є процес незворотної коагуляції білків, внаслідок якого життєдіяльність припиняється, а структури стають мертвими, фіксованими. Фіксація призводить до ущільнення та зменшення об'єму шматочків, а також до поліпшення подальшого забарвлення клітин та тканин.
Ущільнення матеріалу, необхідне приготування зрізів, проводиться шляхом просочування попередньо зневодненого матеріалу парафіном, целлоидином, органічними смолами. Швидше ущільнення досягається застосуванням методу заморожування шматочків, наприклад, рідкої вуглекислоті.
Приготування зрізів відбувається на спеціальних приладах – мікротомах (для світлової мікроскопії) та ультрамікротомах (для електронної мікроскопії).
Фарбування зрізів (у світловій мікроскопії) або напилення їх солями металів (електронної мікроскопії) застосовують збільшення контрастності зображення окремих структур під час розгляду в мікроскопі. Методи забарвлення гістологічних структур дуже різноманітні та вибираються залежно від завдань дослідження.
Гістологічні барвники (за хімічною природою) поділяють на кислі, основні та нейтральні. Як приклад можна навести найбільш уживаний барвник гематоксилін, який забарвлює ядра клітин у фіолетовий колір, і кислий барвник - еозин, що забарвлює цитоплазму в рожево-жовтий колір. Виборча спорідненість структур до певних барвників зумовлена їх хімічним складом та фізичними властивостями. Структури, що добре фарбуються кислими барвниками, називаються оксифільними, а основними, що фарбуються, - базофільними. Наприклад, цитоплазма клітин найчастіше фарбується оксифільно, а ядра клітин - фарбуються базофільно.
Структури, що сприймають як кислі, так і основні барвники, є нейтрофільними (гетерофільними). Забарвлені препарати зазвичай зневоднюють у спиртах зростаючої міцності і просвітлюють у ксилолі, бензолі, толуолі або деяких оліях. Для тривалого збереження зневоднений гістологічний зріз укладають між предметним та покривним склом у канадський бальзам або інші речовини. Готовий гістологічний препарат може бути використаний для вивчення під мікроскопом багато років (Юріна, Радостина 1999).
В електронній мікроскопії зрізи, отримані на ультрамікротомі, поміщають на спеціальні сітки, контрастують солями урану, свинцю та інших металів, після чого переглядають у мікроскопі та фотографують. Отримані мікрофотографії є об'єктом вивчення поряд з гістологічними препаратами.
3. Методи мікроскопування гістологічних препаратів
Мікроскопія може бути світлова (з використанням світлового мікроскопа) та електронна (з використанням електронного мікроскопа). Світлова мікроскопія може здійснюватися в світлі, коли світло проходить через тонкий прозорий гістологічний препарат, або ж у відбитому світлі, коли досліджують, наприклад, товстий або непрозорий об'єкт. Аналогічним чином, електронна мікроскопія може бути трансмісійної, коли пучок електронів проходить крізь ультратонкий зріз, що вивчається, або ж растрової, або скануючої, коли пучок електронів відбивається від поверхні досліджуваного об'єкта. У першому випадку електронний мікроскоп називається трансмісійним (ТЕМ), а в другому - скануючим (СЕМ).
1 Світлова мікроскопія
Мікроскопування – основний метод вивчення препаратів – використовується в біології вже понад 300 років. Сучасні мікроскопи є різноманітними складними оптичними системами, що мають високу роздільну здатність і дозволяють вивчати дуже тонкі деталі будови клітин і тканин. Розмір найменшої структури, яку можна бачити в мікроскопі, визначається найменшою роздільною здатністю (d0). В основному воно залежить від довжини світлової хвилі ?, і ця залежність приблизно виражається формулою d0 = ? / 2. Таким чином, чим менша довжина світлової хвилі, тим менша відстань, що дозволяється, і тим менші за розмірами структури можна бачити в препараті (тобто вище «дозвіл» мікроскопа). Поняття «збільшення мікроскопа» відноситься до його оптичної системи та виражається у творі збільшення об'єктиву та окуляра. Однак «дозвіл» мікроскопа залежить від характеристик об'єктива і не залежить від окуляра.
Для вивчення гістологічних препаратів частіше застосовують звичайні світлові мікроскопи різних марок, коли як джерело освітлення використовують природне або штучне світло. Мінімальна довжина хвилі видимої частини спектра світла відповідає приблизно 0,4 мкм (фіолетовий спектр). Отже, для звичайного світлового мікроскопа відстань, що дозволяється, дорівнює приблизно 0,2 мкм, а загальне збільшення (твір збільшення об'єктиву на збільшення окуляра) досягає 2000 разів.
Одиниці вимірювання, що використовуються в гістології: Для вимірювання структур у світловій мікроскопії використовуються переважно мікрометри: 1 мкм становить 0,001 мм; в електронній мікроскопії використовуються нанометри: 1 нм становить 0,001 мкм (Юшканцева 2006)
2 Ультрафіолетова мікроскопія
Це різновид світлової мікроскопії. В ультрафіолетовому мікроскопі використовують короткі ультрафіолетові промені з довжиною хвилі близько 0,2 мкм. Відстань, що дозволяється, тут становить приблизно 0,1 мкм. Отримане в ультрафіолетових променях невидиме оком зображення перетворюється на видиме за допомогою реєстрації на фотопластинці або шляхом застосування спеціальних пристроїв (т.к. люмінесцентний екран, або електронно-оптичний перетворювач) (Юріна 1999)
3 Флюоресцентна (люмінесцентна) мікроскопія
Явлення флюоресценції полягають у тому, що атоми та молекули ряду речовин, поглинаючи короткохвильові промені, переходять у збуджений стан. Зворотний перехід із збудженого стану в нормальний відбувається з випромінюванням світла, але з іншого, більшою довжиною хвилі. У флюоресцентному мікроскопі як джерела світла для збудження флюоресценції застосовують ртутні або ксенонові лампи надвисокого тиску, що володіють високою яскравістю в області спектру 0,25-0,4 мкм (ближні ультрафіолетові промені) і 0,4-0,5 мкм (синьо- промені). Довжина світлової хвилі викликаної флюоресценції завжди більша за довжину хвилі збудливого світла, тому їх поділяють за допомогою світлофільтрів і вивчають зображення об'єкта тільки у світлі флюоресценції. Розрізняють власну, чи первинну, і наведену, чи вторинну, флюоресценцію. Будь-яка клітина живого організму має власну флюоресценцію, проте вона часто буває надзвичайно слабкою. Вторинна флюоресценція виникає при обробці препаратів спеціальними барвниками. флюорохромами<#"justify">Артишевський, А. А. Гістологія з технікою гістологічних
досліджень (1999)
Антипчук, Ю. П. Гістологія з основами ембріології (1983)
Афанасьєв Ю.І., Юрина Н.А. - Гістологія, цитологія та ембріологія (1989) "Медицина"
Афанасьєв Ю.І., Юрина Н.А. - Гістологія, цитологія та ембріологія (2002) "Медицина"
Биков В.Л. Приватна гістологія людини "Сотіс" 1999
Заварзін А.А., Строєва О.Г. - Порівняльна гістологія. Підручник "СпБ" 2000
Кузнєцов С.Л., Мушкамбаров Н.М. - Атлас з гістології, цитології та ембріології "МІА" 2002
Рябов, К. П. Гістологія з основами ембріології: навчальний посібник (1990)
Улумбеков Е.Г., Челишев Ю.А. - Гістологія. Підручник для ВНЗ (1997) "Геотар" 1997
Челишев Ю.А. - Графічні тести з гістології, цитології, ембріології "КДМУ" 2000
Юрина Н.А., Радостіна А.І. - Практикум з гістології, цитології та ембріології "УДН" 1999
Юшканцева С.І., Биков В.Л. - Гістологія, цитологія та ембріологія. Короткий атлас "П-2" 2006
Репетиторство
Потрібна допомога з вивчення якоїсь теми?
Наші фахівці проконсультують або нададуть репетиторські послуги з цікавої для вас тематики.
Надішліть заявкуіз зазначенням теми прямо зараз, щоб дізнатися про можливість отримання консультації.
Основними Об'єктами дослідження є гістологічні препарати, а основним способом дослідження - мікроскопування.
Гістологічний препарат має бути досить прозорим (тонким) та контрастним. Він виготовляється як із живих, так і з мертвих (фіксованих) структур. Препарат може бути суспензією клітин, мазок, відбиток, плівку, тотальний препарат і тонкий зріз.
Процес виготовлення гістологічних препаратів для мікроскопічних досліджень включає такі основні етапи: 1) взяття матеріалу і його фіксація; 2) ущільнення матеріалу; 3) приготування зрізів; 4) фарбування, або контрастування зрізів; 5) укладання зрізів.
Для фарбування застосовуються спеціальні гістологічні барвники з різним значенням рН: кислі, нейтральні та основні. Структури, що фарбуються ними, відповідно, називаються оксифільними, нейтрофільними (гетерофільними) та базофільними.
Якими методами користується гістологічна наука? Вони досить численні та різноманітні:
Мікроскопія.
Світлова мікроскопія. Сучасні мікроскопи мають високодозвільну здатність. Роздільна здатність визначається найменшою відстанню (d) між двома рядом розташованими точками, які можна бачити окремо. Ця відстань залежить від довжини світлової хвилі (λ) та виражається формулою: d = 1/2 λ.
Мінімальна довжина хвилі видимої частини діапазону 0,4 мкм. Отже, роздільна здатність світлового мікроскопа становить 0,2 мкм, а загальне збільшення досягає 2500 разів.
Ультрафіолетова мікроскопія . Довжина хвилі ультрафіолетового світла - 0,2 мкм, отже, роздільна здатність ультрафіолетового мікроскопа 0,1 мкм, але так як ультрафіолетове випромінювання є невидимим, то для спостереження об'єкта, що досліджується, необхідний люмінесцентний екран.
Флюоресцентна (люмінесцентна) мікроскопія. Короткохвильове (невидиме) випромінювання, поглинаючись рядом речовин, збуджує їх електрони, які випромінюють світло з більшою довжиною хвилі, стаючи видимою частиною спектра. Таким чином, домагаються підвищення роздільної здатності мікроскопа.
Фазовоконтрастна мікроскопія дозволяє випромінювати незабарвлені об'єкти.
Поляризаційна мікроскопія застосовується вивчення архітектоніки гістологічних структур, наприклад, колагенового волокна.
Електронна мікроскопія дає можливість вивчати об'єкти, збільшені в десятки тисяч разів.
Мікрофотозйомка та мікрокінозйомка . Ці методи дозволяють вивчати фіксовані об'єкти на фотографіях та живі мікроскопічні об'єкти у русі.
Методи якісних та кількісних досліджень.
Гісто –та цитохімія , у тому числі кількісна, дозволяє проводити якісний аналіз досліджуваних об'єктів на тканинному, клітинному та субклітинному рівнях.
Цитоспектрофотометрія Дає можливість вивчати кількісний вміст тих чи інших біологічних речовин у клітинах та тканинах на основі поглинання світла певної довжини хвилі пов'язаним ними барвником.
Диференційне центрифугування дозволяє розділяти вміст клітин, що відрізняються між собою своєю масою.
Радіографія Заснована на включенні радіоактивної мітки (наприклад, радіоактивного йоду, Н-тимідину та ін) в обмінний процес.
Морфометрія дозволяє проводити вимірювання площ та об'ємів клітин, їх ядер та органел за допомогою окуляр- та об'єкт-мікрометрів та спеціальних сіток.
Застосування ЕОМ для автоматичного оброблення цифрового матеріалу.
Метод культури тканинє підтримкою життєздатності і поділу клітин і тканин поза організмом. Для цього використовують спеціальні контейнери з живильним середовищем, у яких створюються всі необхідні умови для життєдіяльності клітин. За допомогою цього методу можна вивчати диференціювання та функціональне становлення клітин, закономірності їх злоякісного переродження та розвитку пухлинного процесу, міжклітинну взаємодію, ураження клітин та тканин вірусами та мікроорганізмами, вплив лікарських препаратів на обмінні процеси в клітинах та тканинах тощо.
Прижиттєве (вітальне) фарбування використовується для вивчення явищ фагоцитозу та активності макрофагів, фільтраційної здатності ниркових канальців та ін.
Метод трансплантації тканин. Цей метод застосовують з метою вивчення поведінки клітин та їх морфофункціонального стану при їх пересадці в інший організм. Наприклад, цей спосіб використовується підтримки життя тварин, схильних до опромінення смертельної дозою.
Мікроманіпуляція. Цей методотримав застосування в молекулярній біології, генної інженерії, а також при клонуванні, коли за допомогою мікроманіпулятора видаляють ядро з яйцеклітини з гаплоїдним набором хромосом і пересаджують ядро соматичної клітини з диплоїдним набором хромосом.
Цей метод є основним, чи класичним. Для їх виготовлення об'єкт дослідження провантажують у фіксуючі рідини, які денатурують білки та стабілізують певні структури та сполуки, що підлягають дослідженню. Найбільш поширеним фіксатором є формалін. Він зшиває білки метиленовими містками, викликаючи їхню денатурацію. Після фіксування і промивання у воді об'єкт дослідження можна різати на тонкі пластинки, попередньо заморозивши його на спеціальному мікротомі приладі, за допомогою якого виготовляють гістологічні зрізи. Для заморожування об'єкта найчастіше використовують рідкий вуглекислий газ чи електрозаморожуючу установку. Однак за такого методу обробки матеріалу отримують досить товсті гістологічні зрізи. Для виготовлення тонших зрізів, товщиною до 2 мкм, об'єкт дослідження необхідно просочити речовиною, яка зробила б його щільнішим. Такими речовинами є парафін, желатин та целоїдин. Об'єкт після фіксування та промивання занурюють послідовно в спирти зростаючої концентрації від 50 до 100 градусів для його зневоднення і просочують желатиною, парафіном або целоїдином. Після просочування та ущільнення об'єкта його можна різати на мікротомі.Гістологічні зрізи потім фарбують спеціально підібраними барвниками, більшість з яких вибірково фарбує структурні компоненти клітин та тканин. Усі барвники можна розділити на три групи:
Після фарбування гістологічні зрізи швидко зневоднюють у спиртах, просвітлюють у ксилолі або толуолі, переносять на предметне скло, заливають тонким шаром канадського бальзами або полістиролу та накривають покривним склом. Бальзам, полістирол та скло мають однаковий показник заломлення світла, і промені світла мінімально розсіюються, проходячи через препарат.
