Fra den juridiske siden er en fullmakt et offisielt dokument som er utarbeidet...
Histologi – (“histos” på gresk – vev, logis – studie) Dette er vitenskapen om strukturen, utviklingen og vitale aktiviteten til vev fra flercellede organismer og mennesker. Gjenstander som er gjenstand for denne vitenskapen er utilgjengelige for det blotte øye. Derfor er histologiens historie nært forbundet med historien om opprettelsen av slike enheter som gjør det mulig å studere de minste gjenstandene med det blotte øye. 2
Histologikurset er delt inn i følgende seksjoner: n 1. Cytologi - vitenskapen om celler. n 2. Embryologi er vitenskapen om utvikling, fra unnfangelse til full dannelse av organismen. n 3. Generell histologi er vitenskapen om de generelle mønstrene som er iboende i vev. n 4. Spesiell histologi - studerer struktur og utvikling av organer og systemer.
CYTOLOGI – (gresk κύτος «celle» og λόγος – «lære», «vitenskap») n En gren av biologi som studerer levende celler, deres organeller, deres struktur, funksjon, prosesser for celleproduksjon, aldring og død. 4
EMBRYOLOGI n (fra gammelgresk ἔμβρυον - embryo, embryo + -λογία fra λόγος - undervisning) er en vitenskap som studerer utviklingen av embryoet. 5
Historien om etableringen av celleteorien 1590. Jansen oppfant et mikroskop der forstørrelsen ble oppnådd ved å koble sammen to linser. 1665 Robert Hooke brukte først begrepet celle. 1650 -1700. Anthony van Leeuwenhoek var den første som beskrev bakterier og andre mikroorganismer. 1700 -1800. Mange nye beskrivelser og tegninger av ulike vev, hovedsakelig plante, er publisert. I 1827 oppdaget Karl Baer egget hos pattedyr. 1831 -1833. Robert Brown beskrev kjernen i planteceller. 1838 -1839. Botaniker Matthias Schleiden og zoolog Theodor Schwann kombinerte ideene til forskjellige forskere og formulerte celleteorien, som postulerte at den grunnleggende enheten for struktur og funksjon i levende organismer er cellen. 1855 Rudolf Virchow viste at alle celler dannes som et resultat av celledeling.
Historien om etableringen av celleteori 1665. Den engelske forskeren og fysikeren Robert Hooke undersøkte en del av korken under et mikroskop, og oppdaget at den består av celler adskilt av skillevegger. Han kalte disse cellene "celler"
Historien om etableringen av celleteori På 1600-tallet designet Leeuwenhoek et mikroskop og åpnet døren til mikroverdenen for mennesker. En rekke ciliater, hjuldyr og andre bittesmå levende skapninger blinket foran øynene til de forbløffede forskerne. Det viste seg at de er overalt - disse bittesmå organismene: i vann, gjødsel, i luft og støv, i bakken og takrenner, i råtnende avfall av animalsk og planteopprinnelse.
Historien om etableringen av celleteori 1831 -1833. Robert Brown beskrev kjernen i planteceller. I 1838 trakk den tyske botanikeren M. Schleiden oppmerksomheten til kjernen og anså den for å være cellens produsent. Ifølge Schleiden kondenserer en kjerne fra det granulære stoffet, som det dannes en kjerne rundt, og rundt kjernen en celle, og kjernen kan forsvinne under dannelsen av cellen.
Historien om etableringen av celleteorien Den tyske zoologen T. Schwann viste at dyrevev også er sammensatt av celler. Han skapte en teori som sier at celler som inneholder kjerner utgjør det strukturelle og funksjonelle grunnlaget for alle levende ting. Den cellulære strukturteorien ble formulert og publisert av T. Schwann i 1839. Dens essens kan uttrykkes i følgende bestemmelser: 1. Cellen er den elementære strukturelle enheten i strukturen til alle levende vesener; 2. Celler av planter og dyr er uavhengige, homologe med hverandre i opprinnelse og struktur. Hver celle fungerer uavhengig av de andre, men sammen med alle andre. 3. Alle celler oppstår fra strukturløs intercellulær substans. (Feil!) 4. Cellens vitale aktivitet bestemmes av membranen. (Feil!)
Historien om etableringen av celleteorien I 1855 gjorde den tyske legen R. Virchow en generalisering: en celle kan bare oppstå fra en tidligere celle. Dette førte til erkjennelsen av det faktum at vekst og utvikling av organismer er assosiert med celledeling og deres videre differensiering, noe som fører til dannelse av vev og organer.
Historien om opprettelsen av celleteorien av Karl Baer Tilbake i 1827 oppdaget Karl Baer egget hos pattedyr og beviste at utviklingen av pattedyr begynner med et befruktet egg. Dette betyr at utviklingen av enhver organisme begynner med ett befruktet egg; cellen er utviklingsenheten.
Historien om celleteoriens tilblivelse 1865 Arvelighetslovene ble publisert (G. Mendel). 1868 Nukleinsyrer ble oppdaget (F. Miescher) 1873 Kromosomer ble oppdaget (F. Schneider) 1874 Mitose ble oppdaget i planteceller (I. D. Chistyakov) 1878 Mitotisk deling av dyreceller ble oppdaget (W. Fleming, P. I. Peremezhko) 1879 Fleming - oppførsel av kromosomer under deling. 1882 Meiose ble oppdaget i dyreceller (W. Fleming) 1883 Det ble vist at antallet kromosomer i kjønnsceller er halvparten av antallet kromosomer i somatiske celler (E. Van Beneden) 1887 Meiose ble oppdaget i planteceller (E. Strassburger ) 1898 Golgi oppdaget det retikulære apparatet til cellen, Golgi-apparatet. 1914 Den kromosomale teorien om arvelighet ble formulert (T. Morgan). 1924 En naturvitenskapelig teori om opprinnelsen til livet på jorden ble publisert (A.I. Oparin). 1953 Ideer om strukturen til DNA ble formulert og modellen ble laget (D. Watson og F. Crick). 1961 Naturen og egenskapene til den genetiske koden bestemmes (F. Crick, L. Barnett, S. Benner).
Grunnleggende bestemmelser i moderne celleteori 1. En celle er et elementært levende system, en enhet av struktur, livsaktivitet, reproduksjon og individuell utvikling organismer. 2. Cellene til alle levende organismer er homologe, de samme i struktur og opprinnelse. 3. Celledannelse. Nye celler oppstår bare ved å dele eksisterende celler. 4. Celle og organisme. En celle kan være en uavhengig organisme (prokaryoter og encellede eukaryoter). Alle flercellede organismer består av celler. 5. Cellefunksjoner. Cellene utfører: metabolisme, irritabilitet og eksitabilitet, bevegelse, reproduksjon og differensiering. 6. Celleevolusjon. Cellulær organisasjon oppsto ved livets morgen og gikk gjennom en lang utviklingsvei fra ikke-nukleære former (prokaryoter) til nukleære (eukaryoter).
METODER FOR MIKROSKOPI AV HITOLOGISKE Preparater 1. Lysmikroskopi. 2. Ultrafiolett mikroskopi. 3. Fluorescerende (luminescerende) mikroskopi. 4. Fasekontrastmikroskopi. 5. Mørkefeltmikroskopi. 6. Interferensmikroskopi 7. Polarisasjonsmikroskopi. 8. Elektronmikroskopi. 17
Mikroskop n Dette optiske instrumentet lar deg observere små gjenstander. Bildeforstørrelse oppnås med et system med objektivlinser og okular. Speilet, kondensatoren og diafragmaen styrer lysstrømmen og regulerer belysningen av objektet. Den mekaniske delen av mikroskopet inkluderer: et stativ, en scene, makro- og mikrometerskruer og en rørholder. 18
Spesielle mikroskopimetoder: - fasekontrastmikroskop - (for å studere levende, umalte gjenstander) - mikroskopi lar deg studere levende og umalte gjenstander. Når lys passerer gjennom malte gjenstander, endres amplituden til lysbølgen, og når lys passerer gjennom umalte gjenstander, endres lysbølgens fase, som brukes til å få bilder med høy kontrast i fasekontrast- og interferensmikroskopi. - mørkfeltsmikroskop (for å studere levende umalte gjenstander). En spesiell kondensator brukes til å fremheve de kontrasterende strukturene til det umalte materialet. Mørkefeltsmikroskopi lar deg observere levende objekter. Det observerte objektet ser ut som om det var opplyst i et mørkt felt. I dette tilfellet faller strålene fra illuminatoren på objektet fra siden, og bare spredte stråler kommer inn i mikroskoplinsene. 19
Spesielle metoder for mikroskopi: fluorescerende mikroskopi (for å studere levende, umalte objekter) mikroskopi brukes til å observere fluorescerende (luminescerende) objekter. I et fluorescensmikroskop passerer lys fra en kraftig kilde gjennom to filtre. Ett filter stopper lys foran prøven og sender lys med bølgelengden som eksiterer fluorescens fra prøven. Et annet filter lar lys med bølgelengden som sendes ut av det fluorescerende objektet passere gjennom. Således absorberer fluorescerende objekter lys med en bølgelengde og sender ut i en annen region av spekteret. - ultrafiolett evne til m-pa) mik-p (øker oppløsningen - polarisering mik-p (for å studere objekter med et ordnet arrangement av molekyler - skjelettmuskulatur, kollagenfibre osv.) mikroskopi - bildedannelse av ufargede anisotrope strukturer (f. eksempel kollagenfibre og myofibriller).20
Spesielle mikroskopimetoder - interferensmikroskopi (for å bestemme den tørre resten i celler, bestemme tykkelsen på objekter) - mikroskopi kombinerer prinsippene for fasekontrast og polarisasjonsmikroskopi og brukes til å få et kontrastbilde av umalte objekter. Spesiell interferensoptikk (Nomarski-optikk) har funnet anvendelse iikroskoper. B. Elektronmikroskopi: -transmisjon (studie av objekter gjennom transmisjon) -scanning (studie av overflaten til objekter) Teoretisk er oppløsningen av transmisjon EM 0,002 nm. Den faktiske oppløsningen til moderne mikroskoper nærmer seg 0,1 nm. For biologiske objekter er EM-oppløsningen i praksis 2 nm. 21
Spesielle mikroskopiteknikker Et transmisjonselektronmikroskop består av en kolonne der elektroner som sendes ut av en katodefilament passerer i vakuum. En elektronstråle, fokusert av ringmagneter, passerer gjennom den forberedte prøven. Naturen til elektronspredning avhenger av tettheten til prøven. Elektroner som passerer gjennom prøven fokuseres, observeres på en fluorescerende skjerm og registreres ved bruk av en fotografisk plate. Et skanningselektronmikroskop brukes til å få et tredimensjonalt bilde av overflaten til objektet som studeres. Chipping-metoden (frysing-chipping) brukes til å studere intern struktur cellemembraner. Cellene fryses ved flytende nitrogentemperatur i nærvær av et kryobeskyttelsesmiddel og brukes til å lage chips. Spaltningsplanene passerer gjennom den hydrofobe midten av lipid-dobbeltlaget. Den eksponerte indre overflaten av membranene er skyggelagt med platina, og de resulterende kopiene studeres i en skannings-EM. 22
Spesielle (ikke-mikroskopiske) metoder: 1. Cyto- eller histokjemi - essensen er bruken av strengt spesifikke kjemiske reaksjoner med et lett sluttprodukt i celler og vev for å bestemme mengden av ulike stoffer (proteiner, enzymer, fett, karbohydrater osv.). Kan påføres på lys- eller elektronmikroskopnivå. 2. Cytofotometri - metoden brukes i kombinasjon med 1 og gjør det mulig å kvantitativt vurdere proteiner, enzymer etc. identifisert ved den cytohistokjemiske metoden 3. Autoradiografi - stoffer som inneholder radioaktive isotoper introduseres i kroppen kjemiske elementer. Disse stoffene inngår i metabolske prosesser i cellene. Lokaliseringen og videre bevegelser av disse stoffene i organene bestemmes av histologiske preparater ved stråling, som fanges opp av en fotografisk emulsjon påført preparatet. 4. Røntgenstrukturanalyse - lar deg bestemme mengden av kjemiske elementer i celler og studere den molekylære strukturen til biologiske mikroobjekter. 24 5. Morfometri - måling av biolstørrelser. strukturer på celle- og subcellulært nivå.
Spesielle (ikke-mikroskopiske) metoder 6. Mikrourgi - utføre meget fine operasjoner med mikromanipulator under mikroskop (transplantere kjerner, introdusere ulike stoffer i celler, måle biopotensialer, etc.) 6. Metode for å dyrke celler og vev - i næringsmedier eller i diffusjonskamre, implantert i ulike vev i kroppen. 7. Ultrasentrifugering - fraksjonering av celler eller subcellulære strukturer ved sentrifugering i løsninger med varierende tetthet. 8. Eksperimentell metode. 9. Metode for vevs- og organtransplantasjon. 25
Fiksering bevarer strukturen til celler, vev og organer, forhindrer deres bakterielle kontaminering og enzymatisk fordøyelse, stabiliserer makromolekyler ved kjemisk tverrbinding. 32
Fiksering av flytende formalin, alkoholer, glutaraldehyd - De vanligste fikseringsmidlene; Kryofiksering - Bedre bevaring av strukturer sikres ved øyeblikkelig frysing av prøver i flytende nitrogen (– 196 °C); Lyofilisering - små biter av vev fryses raskt, og stopper metabolske prosesser. Dehydrering - en standardprosedyre for å fjerne vann - dehydrering i alkoholer med økende styrke (fra 70 til 60%). Fylling – gjør stoffet slitesterkt, hindrer det i å bli knust og rynket ved skjæring, og gjør det mulig å få seksjoner med standardtykkelse. Det vanligste innstøpingsmediet er parafin. Celloidin, plastmedier og harpikser brukes også. 33
Dehydrering forbereder det fikserte vevet for penetrering av embedding media. Vann av levende vev, samt vann av fikseringsblandinger (de fleste fikseringsmidler er vandige løsninger) etter fiksering må fjernes helt. Standard prosedyre fjerning av vann - dehydrering i alkoholer med økende styrke fra 60° til 100°. 34
Helling er en nødvendig prosedyre før du forbereder seksjoner. Fylling gjør stoffet slitesterkt, forhindrer at det knuses og rynkes ved skjæring, og gjør det mulig å få tynne partier av standardtykkelse. Det vanligste innstøpingsmediet er parafin. Celloidin, plastmedier og harpikser brukes også. 35
Roterende mikrotom. 40 n Blokker som inneholder et stykke av et orgel er festet i en bevegelig gjenstandsholder. Når den senkes, forblir serielle seksjoner på kniven; de fjernes fra kniven og monteres på en glassplate for påfølgende behandling og mikroskopi.
Metoder for farging av histologiske snitt: n Nukleær (hoved): n hematoxylin – flekker n n n n kjerner i Blå farge; jern hematoxylin; Azur II (i lilla); karmin (i rødt); safranin (i rødt); metylblått (blått); toluidin (blå); tionin (blått). n Cytoplasmatisk- (sur): n eosin – rosa; n erytrosin; n oransje "G"; n sur magenta – rød; n pikrinsyre - gul; n Kongo – rød – til rød 44
SPESIELLE Metoder for farging av histologiske snitt n Sudan III – farging av lipider og fett oransje; n osmisk syre – farge av lipider og fett svart; n orcein - farging av elastiske fibre brun; n sølvnitrat – impregnering av nerveelementer i mørk brun farge. 45
Cellestrukturer: n OXYPHILIAn evnen til å farges rosa med sure fargestoffer n Basophilian evnen til å farges blå med basiske fargestoffer n Neutrophilia - n evnen til å farges fiolett med sure og basiske fargestoffer. 47
1
Celle n er et elementært levende system som består av cytoplasma, kjerne, membran og er grunnlaget for utvikling, struktur og liv til dyre- og planteorganismer.
Glykokalyxen er et supramembrankompleks som består av sakkarider assosiert med proteiner og sakkarider assosiert med lipider. Funksjoner n Mottak (hormoner, cytokiner, mediatorer og antigener) n Intercellulære interaksjoner (irritabilitet og gjenkjennelse) n Parietal fordøyelse (mikrovilli av tarmkantceller)
Funksjoner av cytolemma: - avgrensende; - aktiv og passiv transport av stoffer i begge retninger; - reseptorfunksjoner; - kontakt med naboceller.
I moderne histologi, cytologi og embryologi brukes ulike forskningsmetoder for å studere prosessene for utvikling, struktur og funksjon av celler, vev og organer.
Hovedstadiene av cytologisk og histologisk analyse er valg av et studieobjekt, dets forberedelse for undersøkelse under et mikroskop, bruk av mikroskopimetoder, samt kvalitativ og kvantitativ bildeanalyse.
Forskningsobjektene er levende og døde (fikserte) celler og vev, og deres bilder tatt i lys- og elektronmikroskop.
Hovedformålet med studien er histologiske preparater, utarbeidet fra faste strukturer. Stoffet kan være smøre(for eksempel et utstryk av blod, benmarg, spytt, cerebrospinalvæske, etc.), avtrykk(for eksempel milt, thymus, lever), film laget av vev (for eksempel binde- eller peritoneum, pleura, pia mater), tynn skive. Oftest brukes en del av vev eller organ til studier. Histologiske preparater kan studeres uten spesiell behandling. For eksempel kan et forberedt blodutstryk, trykk, film eller organseksjon umiddelbart undersøkes under et mikroskop. Men på grunn av det faktum at strukturene har svak kontrast, er de dårlig synlige i et konvensjonelt lysmikroskop og bruk av spesielle mikroskoper (fasekontrast, etc.) er nødvendig. Derfor brukes spesielt behandlede preparater oftere: faste, innelukket i et fast medium og farget.
Prosessen med å lage en histologisk prøve for lys- og elektronmikroskopi inkluderer følgende hovedtrinn:
- 1. ta materialet og fikse det,
- 2. materialkomprimering,
- 3. utarbeidelse av seksjoner,
- 4. flekker eller kontrasterende seksjoner.
For lysmikroskopi kreves ett trinn til - omsluttende seksjoner i balsam eller andre transparente medier.
Fiksering sikrer forebygging av nedbrytningsprosesser, noe som bidrar til å opprettholde integriteten til strukturer. Dette oppnås ved at en liten prøve tatt fra organet enten nedsenkes i et fikseringsmiddel (alkohol, formaldehyd, løsninger av tungmetallsalter, osmisk syre, spesielle fikseringsblandinger) eller utsettes for varmebehandling. Under påvirkning av fikseringsmidlet oppstår komplekse fysiske og kjemiske endringer i vev og organer. Den viktigste av dem er prosessen med irreversibel koagulering av proteiner, som et resultat av hvilken vital aktivitet opphører, og strukturene blir døde og fikserte. Fiksering fører til komprimering og reduksjon i volumet av delene, samt til en forbedring i den påfølgende fargingen av celler og vev.
Tetning Materialet som kreves for å forberede seksjoner er produsert ved å impregnere tidligere dehydrert materiale med parafin, celloidin og organiske harpikser. Raskere komprimering oppnås ved å bruke metoden for å fryse stykkene, for eksempel i flytende karbondioksid.
Utarbeidelse av seksjoner forekommer på spesielle enheter - mikrotomer(for lysmikroskopi) og ultramikrotomer(for elektronmikroskopi). Se link - enheter for å lage skiver.
Fargelegging seksjoner (i lysmikroskopi) eller sputtering av dem med metallsalter (i elektronmikroskopi) brukes til å øke kontrasten til bildet av individuelle strukturer når de sees under et mikroskop. Metoder for farging av histologiske strukturer er svært forskjellige og velges avhengig av målene for studien. Se forumet histologiske teknikker.
Histologiske fargestoffer (i henhold til deres kjemiske natur) er delt inn i sure, basiske og nøytrale. Et eksempel er det mest brukte fargestoffet hematoksylin, som farger cellekjerner lilla, og surt fargestoff - eosin, farging av cytoplasmaet rosa-gult. Den selektive affiniteten til strukturer for visse fargestoffer skyldes deres kjemisk oppbygning Og fysiske egenskaper. Strukturer som flekker godt med sure fargestoffer kalles oksyfil, og de som er farget med de viktigste - basofil. For eksempel er cytoplasmaet til celler oftest farget oksyfilt, og cellekjernene er farget basofile.
Strukturer som aksepterer både sure og basiske fargestoffer er nøytrofile (heterofile). Fargede preparater dehydreres vanligvis i alkoholer med økende styrke og renses i xylen, benzen, toluen eller noen oljer. For langtidskonservering er den dehydrerte histologiske delen innelukket mellom et objektglass og dekkglass i Canada balsam eller andre stoffer. Den ferdige histologiske prøven kan brukes til studier under mikroskop i mange år.
For elektronmikroskopi plasseres seksjoner oppnådd med en ultramikrotom på spesielle gitter, i kontrast til salter av uran, bly og andre metaller, hvoretter de blir sett under et mikroskop og fotografert. De resulterende mikrofotografiene fungerer som et studieobjekt sammen med histologiske preparater.
UDDANNELSES- OG VITENSKAPSMINISTERIET I DEN RUSSISKE FØDERASJON
FSBEI HPE "SAKHALIN STATE UNIVERSITY"
DET NATURVITENSKAPELIGE FAKULTET
AVDELING FOR ØKOLOGI OG NATURFORVALTNING
TEST
i disiplinen "Histologi og embryologi av fisk"
om temaet "Forskningsmetoder i histologi"
2. års student
Terekhov Stepan Sergeevich
Vitenskapelig rådgiver,
Kunst. Foreleser ved Institutt for økologi og miljøforvaltning
A.V. Boyko
Yuzhno-Sakhalinsk
Introduksjon
Histologi er vitenskapen om særegenhetene ved organisering, funksjoner og utvikling av vev og vevsstrukturen til organer. Hovedobjektet for studiet av histologi er vev, som er fylogenetisk dannet, topografisk og funksjonelt relaterte cellulære systemer og deres derivater, hvorfra organer dannes. For å forstå hvordan det hele fungerer og fungerer, måtte menneskeheten gjennomgå mye, og startet med linsene til Anthony Van Leeuwenhoek, da studiet av alle levende ting, tidligere usett, begynte. Moderne studiemetoder inkluderer den viktigste, mikroskopi.
Hensikt med arbeidet: Vurdere forskningsmetoder innen histologi, lære å arbeide med histologiske preparater og forstå prosessen med å studere vev forskjellige måter mikroskopi.
1. Forskningsmetoder i histologi, grunnlag
Avhengig av studieobjektet er histologi delt inn i normal (studier vev frisk kropp) og patologisk (patohistologi), som studerer vevsendringer under sykdommer og skader (det regnes vanligvis som en gren av patologisk anatomi). På grunn av objektets spesifisitet og forskningsmetoder skilles nevrohistologi ut, så vel som studiet av blod og hematopoiesis, som har blitt teoretisk grunnlag hematologi. I tillegg er det en rekke områder innen histologi - beskrivende histologi (beskrivelse av vev), komparativ histologi (sammenligning av vev) forskjellige typer dyr), evolusjonshistologi (mønstre for vevsutvikling i fylogeni), miljøhistologi (studier vev i forbindelse med påvirkning av levekår), eksperimentell histologi. I histologi brukes en rekke forskningsmetoder - mikroskopi, eksperimentelle, vevskulturer (Afanasyev 1989).
Hovedfaget for studiet av histologi er kompleksene av celler som utgjør vev, i deres interaksjon med hverandre og med mellomliggende miljøer. Histologi er en del av morfologien og er nært knyttet til cytologi, anatomi og embryologi. Det metodiske grunnlaget for histologi er celleteori og evolusjonær undervisning. Histologi er vanligvis delt inn i generell (studerer generelle utviklingsmønstre, struktur og funksjon av vev) og spesifikk (studerer den mikroskopiske strukturen til individuelle organer og systemer i kroppen). Spesielle grener av histologi er histokjemi (vevs kjemi) og histofysiologi (mekanismer for vevsaktivitet) (Yushkantseva 2006).
2. Forskningsmetoder
Forskningsmetoder innen histologi inkluderer fremstilling av histologiske preparater og deres påfølgende studie ved hjelp av et lys- eller elektronmikroskop. Histologiske preparater er utstryk, avtrykk av organer, tynne deler av organstykker, muligens farget med et spesielt fargestoff, plassert på et objektglass, innelukket i et konserveringsmedium og dekket med et dekkglass.
I moderne histologi, cytologi og embryologi brukes ulike forskningsmetoder for å studere prosessene for utvikling, struktur og funksjon av celler, vev og organer.
Hovedstadiene i histologisk analyse er valg av et studieobjekt, dets forberedelse for undersøkelse under et mikroskop, bruk av mikroskopimetoder, samt kvalitativ og kvantitativ bildeanalyse.
Forskningsobjektene er levende og døde (fikserte) celler og vev, og deres bilder tatt i lys- og elektronmikroskop.
Hovedobjektet for studien er histologiske preparater fremstilt fra faste strukturer. Preparatet kan være et utstryk (for eksempel et utstryk av blod, benmarg, spytt, cerebrospinalvæske, etc.), et avtrykk (for eksempel milt, thymus, lever), en film av vev (for eksempel binde- eller peritoneum, pleura, pia mater), tynn skive. Oftest brukes en del av vev eller organ til studier. Histologiske preparater kan studeres uten spesiell behandling. For eksempel kan et forberedt blodutstryk, trykk, film eller organseksjon umiddelbart undersøkes under et mikroskop. Men på grunn av det faktum at strukturene har svak kontrast, er de dårlig synlige i et konvensjonelt lysmikroskop og bruk av spesielle mikroskoper (fasekontrast, etc.) er nødvendig. Derfor brukes spesielt bearbeidede preparater oftere: faste, innelukket i et fast medium og farget (Yurina 1999).
Prosessen med å produsere et histologisk preparat for lys- og elektronmikroskopi inkluderer følgende hovedtrinn:
ta materiale og fikse det,
materialkomprimering,
forberedelse av kutt,
flekker eller kontrasterende seksjoner.
For lysmikroskopi kreves ett trinn til - omsluttende seksjoner i balsam eller andre transparente medier.
Fiksering sikrer forebygging av nedbrytningsprosesser, noe som bidrar til å opprettholde integriteten til strukturene. Dette oppnås ved at en liten prøve tatt fra organet enten nedsenkes i et fikseringsmiddel (alkohol, formaldehyd, løsninger av tungmetallsalter, osmisk syre, spesielle fikseringsblandinger) eller utsettes for varmebehandling. Under påvirkning av fikseringsmidlet oppstår komplekse fysiske og kjemiske endringer i vev og organer. Den viktigste av dem er prosessen med irreversibel koagulering av proteiner, som et resultat av hvilken vital aktivitet opphører, og strukturene blir døde og fikserte. Fiksering fører til komprimering og reduksjon i volumet av delene, samt til en forbedring i den påfølgende fargingen av celler og vev.
Komprimeringen av materialet som er nødvendig for å forberede seksjoner, utføres ved å impregnere det tidligere dehydrerte materialet med parafin, celloidin og organiske harpikser. Raskere komprimering oppnås ved å bruke metoden for å fryse stykkene, for eksempel i flytende karbondioksid.
Seksjoner er forberedt ved hjelp av spesielle enheter - mikrotomer (for lysmikroskopi) og ultramikrotomer (for elektronmikroskopi).
Farging av seksjoner (i lysmikroskopi) eller sputtering av dem med metallsalter (i elektronmikroskopi) brukes til å øke kontrasten til bildet av individuelle strukturer når du ser dem under et mikroskop. Metoder for farging av histologiske strukturer er svært forskjellige og velges avhengig av målene for studien.
Histologiske fargestoffer (i henhold til deres kjemiske natur) er delt inn i sure, basiske og nøytrale. Som et eksempel er det mest brukte fargestoffet hematoxylin, som farger cellekjerner lilla, og det sure fargestoffet eosin, som farger cytoplasmaet rosa-gult. Den selektive affiniteten til strukturer for visse fargestoffer bestemmes av deres kjemiske sammensetning og fysiske egenskaper. Strukturer som flekker godt med sure fargestoffer kalles oksyfile, og de som flekker med basiske fargestoffer kalles basofile. For eksempel er cytoplasmaet til celler oftest farget oksyfilt, og cellekjernene er farget basofile.
Strukturer som aksepterer både sure og basiske fargestoffer er nøytrofile (heterofile). Fargede preparater dehydreres vanligvis i alkoholer med økende styrke og renses i xylen, benzen, toluen eller noen oljer. For langtidskonservering er den dehydrerte histologiske delen innelukket mellom et objektglass og dekkglass i Canada balsam eller andre stoffer. Det ferdige histologiske preparatet kan brukes til studier under mikroskop i mange år (Yurina, Radostina 1999).
I elektronmikroskopi plasseres seksjoner oppnådd med en ultramikrotom på spesielle gitter, i kontrast til salter av uran, bly og andre metaller, hvoretter de blir sett under et mikroskop og fotografert. De resulterende mikrofotografiene fungerer som et studieobjekt sammen med histologiske preparater.
3. Metoder for mikroskopi av histologiske preparater
Mikroskopi kan være lys (ved hjelp av et lysmikroskop) eller elektron (ved hjelp av et elektronmikroskop). Lysmikroskopi kan utføres i transmittert lys, når lys passerer gjennom en tynn, gjennomsiktig histologisk prøve, eller i reflektert lys, når man for eksempel undersøker en tykk eller ugjennomsiktig gjenstand. På samme måte kan elektronmikroskopi være overføring, når en stråle av elektroner passerer gjennom den ultratynne seksjonen som studeres, eller raster eller skanning, når en stråle av elektroner reflekteres fra overflaten til objektet som studeres. I det første tilfellet kalles elektronmikroskopet transmisjonsmikroskop (TEM), og i det andre tilfellet skanneelektronmikroskop (SEM).
1 Lysmikroskopi
Mikroskopi, hovedmetoden for å studere prøver, har blitt brukt i biologi i mer enn 300 år. Moderne mikroskoper er en rekke komplekse optiske systemer som har høy oppløsning og lar en studere veldig fine detaljer om strukturen til celler og vev. Størrelsen på den minste strukturen som kan sees i et mikroskop bestemmes av den minste oppløste avstanden (d0). Det avhenger hovedsakelig av lysets bølgelengde ?, og denne avhengigheten er tilnærmet uttrykt med formelen d0 = ? / 2. Jo kortere lysbølgelengden er, jo mindre er oppløst avstand og jo mindre strukturer kan sees i preparatet (dvs. jo høyere "oppløsning" til mikroskopet). Begrepet "forstørrelse av et mikroskop" refererer til dets optiske system og uttrykkes som produktet av forstørrelsen av linsen og okularet. Imidlertid avhenger "oppløsningen" til et mikroskop av egenskapene til linsen og er uavhengig av okularet.
For å studere histologiske preparater brukes ofte konvensjonelle lysmikroskoper av forskjellige merker, når naturlig eller kunstig lys brukes som belysningskilde. Minimumsbølgelengden til den synlige delen av lysspekteret tilsvarer omtrent 0,4 mikron (fiolett spektrum). Derfor, for et konvensjonelt lysmikroskop, er oppløsningsavstanden omtrent 0,2 μm, og den totale forstørrelsen (produktet av objektivforstørrelsen og okularforstørrelsen) når 2000 ganger.
Måleenheter brukt i histologi: For å måle strukturer i lysmikroskopi brukes i hovedsak mikrometer: 1 μm er 0,001 mm; elektronmikroskopi bruker nanometer: 1 nm er 0,001 mikron (Yushkantseva 2006)
2 Ultrafiolett mikroskopi
Dette er en type lysmikroskopi. Et ultrafiolett mikroskop bruker kortere ultrafiolette stråler med en bølgelengde på omtrent 0,2 mikron. Den oppløste avstanden her er omtrent 0,1 µm. Et bilde som er usynlig for øyet, oppnådd i ultrafiolette stråler, konverteres til et synlig ved å ta opp på en fotografisk plate eller ved å bruke spesielle enheter (som en fluorescerende skjerm eller en elektron-optisk omformer) (Yurina 1999)
3 Fluorescens (luminescens) mikroskopi
Fenomenene med fluorescens består i det faktum at atomer og molekyler av en rekke stoffer, som absorberer kortbølgede stråler, går inn i en eksitert tilstand. Den omvendte overgangen fra eksitert tilstand til normaltilstand skjer med emisjon av lys, men med en annen, lengre bølgelengde. I et fluorescensmikroskop brukes ultrahøytrykks kvikksølv- eller xenonlamper som lyskilder for å eksitere fluorescens, som har høy lysstyrke i spektralområdet på 0,25-0,4 μm (nær ultrafiolette stråler) og 0,4-0,5 μm (blåfiolette stråler) ). stråler). Lysbølgelengden til den fremkalte fluorescensen er alltid større enn bølgelengden til det spennende lyset, så de separeres ved hjelp av lysfiltre og bildet av objektet studeres kun i fluorescenslys. Det skilles mellom indre, eller primær, og indusert, eller sekundær, fluorescens. Enhver celle i en levende organisme har sin egen fluorescens, men den er ofte ekstremt svak. Sekundær fluorescens oppstår når medisiner behandles med spesielle fargestoffer - fluorokromer<#"justify">Artishevsky, A. A. Histologi med histologiske teknikker
Forskning (1999)
Antipchuk, Yu. P. Histologi med det grunnleggende om embryologi (1983)
Afanasyev Yu.I., Yurina N.A. - Histologi, cytologi og embryologi (1989) "Medisin"
Afanasyev Yu.I., Yurina N.A. - Histologi, cytologi og embryologi (2002) "Medisin"
Bykov V.L. Privat human histologi "Sotis" 1999
Zavarzin A.A., Stroeva O.G. - Sammenlignende histologi. Lærebok "SPB" 2000
Kuznetsov S.L., Mushkambarov N.N. - Atlas for histologi, cytologi og embryologi "MIA" 2002
Ryabov, K.P. Histologi med det grunnleggende om embryologi: opplæringen (1990)
Ulumbekov E.G., Chelyshev Yu.A. - Histologi. Lærebok for universiteter (1997) "Geotar" 1997
Chelyshev Yu.A. - Grafiske tester i histologi, cytologi, embryologi "KSMU" 2000
Yurina N.A., Radostina A.I. - Workshop om histologi, cytologi og embryologi "UDN" 1999
Yushkantseva S.I., Bykov V.L. - Histologi, cytologi og embryologi. Kort atlas "P-2" 2006
Læring
Trenger du hjelp til å studere et emne?
Våre spesialister vil gi råd eller gi veiledningstjenester om emner som interesserer deg.
Send inn søknaden din angir emnet akkurat nå for å finne ut om muligheten for å få en konsultasjon.
Hoved Gjenstander for forskning er histologiske preparater, og hovedforskningsmetoden er mikroskopi.
Den histologiske prøven må være tilstrekkelig gjennomsiktig (tynn) og kontrast. Den er laget av både levende og døde (faste) strukturer. Prøven kan være en suspensjon av celler, et utstryk, et avtrykk, en film, en total montering eller en tynn seksjon.
Prosessen med å produsere histologiske preparater for mikroskopiske studier inkluderer følgende hovedstadier: 1) ta materiale og fikse det; 2) materialkomprimering; 3) utarbeidelse av seksjoner; 4) flekker eller kontrasterende seksjoner; 5) konklusjon av avsnitt.
For farging brukes spesielle histologiske fargestoffer med forskjellige pH-verdier: sure, nøytrale og basiske. Strukturene farget av dem kalles henholdsvis oksyfile, nøytrofile (heterofile) og basofile.
Hvilke metoder bruker histologisk vitenskap? De er ganske mange og varierte:
Mikroskopering.
Lysmikroskopi. Moderne mikroskoper har høyoppløsningsmuligheter. Oppløsningen bestemmes av den minste avstanden (d) mellom to tilstøtende punkter som kan sees separat. Denne avstanden avhenger av lysets bølgelengde (λ) og uttrykkes med formelen: d = 1/2 λ.
Minimumsbølgelengden til den synlige delen av spekteret er 0,4 mikron. Følgelig er oppløsningen til et lysmikroskop 0,2 μm, og den totale forstørrelsen når 2500 ganger.
Ultrafiolett mikroskopi . Bølgelengden til ultrafiolett lys er 0,2 mikron, derfor er oppløsningen til et ultrafiolett mikroskop 0,1 mikron, men siden ultrafiolett stråling er usynlig, er det nødvendig med en fluorescerende skjerm for å observere objektet som studeres.
Fluorescens (luminescens) mikroskopi. Kortbølget (usynlig) stråling, absorbert av en rekke stoffer, eksiterer elektronene deres, som sender ut lys med lengre bølgelengde, og blir den synlige delen av spekteret. På denne måten oppnår vi en økning i oppløsningen til mikroskopet.
Fasekontrastmikroskopi lar deg sende ut umalte gjenstander.
Polarisasjonsmikroskopi brukes til å studere arkitekturen til histologiske strukturer, for eksempel kollagenfiber.
Elektronmikroskopi gjør det mulig å studere gjenstander forstørret titusenvis av ganger.
Mikrofotografering og mikrokino . Disse metodene gjør det mulig å studere faste objekter i fotografier og levende mikroskopiske objekter i bevegelse.
Metoder for kvalitativ og kvantitativ forskning.
Histo –og cytokjemi , inkludert kvantitativ, gir mulighet for en kvalitativ analyse av objektene som studeres på vevs-, celle- og subcellulært nivå.
Cytospektrofotometri Det gjør det mulig å studere det kvantitative innholdet av visse biologiske stoffer i celler og vev basert på absorpsjon av lys med en viss bølgelengde av fargestoffet knyttet til dem.
Differensial sentrifugering lar deg skille innholdet i celler som er forskjellige i masse.
Radiografi Den er basert på inkludering av en radioaktiv markør (for eksempel radioaktivt jod, H³-tymidin, etc.) i den metabolske prosessen.
Morfometri lar deg måle arealene og volumene til celler, deres kjerner og organeller ved hjelp av okularer og objektmikrometre og spesielle rutenett.
Bruk av datamaskiner for automatisk behandling av digitalt materiale.
Vevskulturmetode er vedlikehold av levedyktigheten og delingen av celler og vev utenfor kroppen. Til dette formål brukes spesielle beholdere med et næringsmedium, der alle nødvendige forhold for cellenes liv er opprettet. Ved å bruke denne metoden er det mulig å studere differensiering og funksjonell utvikling av celler, mønstrene for deres ondartede degenerasjon og utvikling av tumorprosessen, intercellulær interaksjon, skade på celler og vev av virus og mikroorganismer, effekten av legemidler på metabolske prosesser i celler og vev osv.
Intravital (vital) farging brukes til å studere fenomenene fagocytose og aktivitet til makrofager, filtreringskapasitet til nyretubuli, etc.
Vevstransplantasjonsmetode. Denne metoden brukes til å studere oppførselen til celler og deres morfofunksjonelle tilstand når de transplanteres inn i en annen organisme. For eksempel brukes denne metoden for å opprettholde livet til dyr som er utsatt for dødelige doser stråling.
Mikromanipulasjon. Denne metoden har blitt brukt i molekylærbiologi, genteknologi, så vel som i kloning, ved bruk av en mikromanipulator fjernes kjernen fra et egg med et haploid sett av kromosomer og kjernen til en somatisk celle med et diploid sett av kromosomer blir transplantert inn i det .
Denne metoden er den viktigste, eller klassiske. For å lage dem blir testpersonen nedsenket i fikseringsvæsker, som denaturerer proteiner og stabiliserer de spesifikke strukturene og forbindelsene som skal undersøkes. Det vanligste fikseringsmidlet er formalin. Det tverrbinder proteiner med metylenbroer, noe som får dem til å denaturere. Etter fiksering og vasking i vann, kan studieobjektet kuttes i tynne skiver, etter først å ha frosset det på en spesiell frysemikrotom - en enhet som brukes til å forberede histologiske seksjoner. For å fryse en gjenstand brukes oftest flytende karbondioksid eller en elektrisk fryseenhet. Med denne metoden for bearbeiding av materialet oppnås imidlertid ganske tykke histologiske seksjoner. For å produsere tynnere seksjoner, opptil 2 mikron tykke, må undersøkelsesobjektet være impregnert med et stoff som vil gjøre det tettere. Slike stoffer er parafin, gelatin og celloidin. Etter fiksering og vasking blir gjenstanden sekvensielt nedsenket i alkoholer med økende konsentrasjoner fra 50 til 100 grader for å dehydrere den og impregnert med gelatin, parafin eller celloidin. Når gjenstanden er gjennomvåt og komprimert, kan den kuttes ved hjelp av en mikrotom.Histologiske snitt farges deretter med spesielt utvalgte fargestoffer, hvorav de fleste selektivt farger de strukturelle komponentene i celler og vev. Alle fargestoffer kan deles inn i tre grupper:
Etter farging blir histologiske seksjoner raskt dehydrert i alkoholer, renset i xylen eller toluen, overført til et glassglass, dekket med et tynt lag Canadabalsam eller polystyren og dekket med et dekkglass. Balsam, polystyren og glass har samme lysbrytningsindeks, og lysstråler spres minimalt når de passerer gjennom preparatet.
